規格:50次
價格:5860元
產品及特點:
熒光定量PCR是在PCR體系中加入熒光化合物(熒光染料或熒光探針)。利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,使每個循環變得“可見”。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測.雙歧桿菌屬通用的試劑盒。
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據.雙歧桿菌屬通用高度保守區設計,不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
規格及成分
成分
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編號
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十孔盒包裝
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探針法 qRT-PCR 緩沖液
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A
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500μL(黃蓋)
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探針法 qRT-PCR 酶混合液
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100μL(紅蓋)
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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C
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1 mL(黃蓋)
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.雙歧桿菌屬通用探針法 qRT-PCR引物混合液
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D
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100 μL(白蓋)
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.雙歧桿菌屬通用 qRT-PCR 探針
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E
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50 μL(棕色管)
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.雙歧桿菌屬通用探針法 qRT-PCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)
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F
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50 μL(黃蓋)
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核酸釋釋劑(試用裝)
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G
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20 次(1mL,綠蓋)
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使用手冊
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H
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一份
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運輸及保存: 低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。
自備試劑:樣品 RNA。
使用方法
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有N個樣品,好設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板,省略了RNA提取步驟。
三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記N+9個PCR 管,其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復,則標記N+4 個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(用第4號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加):
成分
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樣品管N+2個
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RT-PCR陰性對照管
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標準曲線樣品管
(2-7 管)
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探針法qPCR緩沖液
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各 10 μL
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10 μL
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各 10 μL
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探針法 qPCR 酶混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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.雙歧桿菌屬通用qRT-PCR探針
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各 1 μL
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1 μL
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各 1 μL
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.雙歧桿菌屬通用探針qRT-PCR
引物混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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待測樣品 RNA 模板
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各 5 μL
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超純水
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5 μL
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第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7 號)
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各5 μL(2號樣到2號管,3號樣到3 號管…)
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11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 qRT-PCR:
過程
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溫度
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時間
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逆轉錄
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50℃
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30 min
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預變性
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94℃
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10 min
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qRT-PCR 反應(40 個循環)
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94℃
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15 sec
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60℃
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1 min(采集 FAM 通道的熒光信號)
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五、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 35,則為陽性。
六、常見問題與解決方法:
常見問題
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可能原因
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解決方法
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陽性對照、待測樣本均無條帶。
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PCR反應體系或反應條件不合適。
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使用梯度PCR摸索PCR反應條件。
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PCR試劑保存不當失去活性。
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2× PCR Mix應保存于-20℃,使用時避免反復凍融。若使用頻繁,可在4℃短時間存放。
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引物設計問題。
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嘗試重新設計引物進行檢查。
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陽性對照有目的條帶,待測樣本無條帶或條帶弱。
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不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。
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使用新鮮的試劑。
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加入組織裂解液過量。
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增大反應體系,或減少裂解液的用量。
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樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久,DNA基因組已經降解。
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裂解混合液液可在4℃保存2-3天,盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。
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模板加入量不適合。
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在反應體系10-20%范圍內優化模板加入量。反應效性能較差時,可以降模板濃度調節到低于10%的范圍。
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PCR循環數不足。
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適當增加PCR的循環數,推薦在35-40循環為佳。因為模板復雜,一般PCR反應要比用純化的 DNA模板多5-10個循環為佳。
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非特異性擴增
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PCR退火溫度太低,循環數、引物濃度或模板濃度太高。
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增加PCR退火溫度,降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。
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PCR引物錯配。
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重新設計PCR引物。
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配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。
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PCR反應體系的配制在低溫下進行,配制完成后盡快進行PCR擴增反應。
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陰性對照出現目的條帶
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操作工具或試劑污染。
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實驗所有試劑或器材均應高壓滅。操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。
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樣本間交叉污染。
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每個取樣器只對一個樣本使用;或取完一個樣本后,將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中,反復涮洗,然后用干凈的紙巾擦干殘液。
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